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熒光定量PCR儀選擇要點及誤區

熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實驗結果準確,受到越來越多的分子生物學研究者青睞。在實驗技術成熟的今天,也許對你來說,最難得不是實驗技術上的問題——而是選擇哪一種熒光定量PCR儀——你要征詢實驗室成員的意見、分析實驗室目前乃至將來的需求、平衡實驗室的預算,更要詳細研究各種極富誘惑力的宣傳資料。面對各種不同性能的產品,您又該如何選擇呢?

首先建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個誤區:

誤區一:儀器通道越多越好

隨著PCR技術的成熟運用,多重擴增越來越熱鬧,熒光定量PCR儀也不能幸免。從最初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發展到如今各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀,眼花繚亂的選擇讓人無所適從,就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區。

在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時,為了確保實驗結果的精確性和準確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或專用的Reference dye ,這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來,真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個,而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的,有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要,不能單單只聽宣傳。
考慮多重熒光定量PCR的通道數的時候也應該從實驗室實際情況出發,多重PCR并非人人適用、人人可用,因為它使實驗復雜化了。

誤區二:real-time PCR儀無需梯度功能

對于使用染料法的定量PCR反應,雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度(Tm值),但運用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化,對于特殊片斷,經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果,退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內按照梯度變化,根據結果,一步就可以摸索出最適合的反應條件。

不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個非常重要,因為Taq和校正酶的最佳反應溫度可能有顯著差異,優化延伸溫度就顯得很重要。

使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優化過程,簡化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實驗,既節省實驗時間提高效率,又節省實驗成本。

當我們走出誤區,想要選擇一款最適合自己需求的熒光定量PCR儀時我們又該關注些什么呢?
1、 儀器的檢測通量
在購買定量PCR儀的時候要根據實驗實的需要來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR的檢測通量小到16個多到384個。如果進行一般的基因表達研究或病原體檢測,實在不必購買昂貴的儀器,96孔的通量足夠用;需要尋找要新藥靶點和疾病標記的實驗室可以考慮購買384孔板的儀器。假如經費有限無法購買384孔板儀器的實驗室,可以考慮購買運行速度快(帶有FAST模塊)的96孔板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器,你會發現樣品的制備和小體系、多樣本的PCR體系構建成為限制實驗速度和結果的頸瓶。Roche公司推出的MagnaPure核算純化系統可配合Roche的Lightcycyler熒光定量PCR儀使用。Eppendorf 的ep Motion5070、5075全自動工作站,即可解決核酸純化問題,又可進行96孔板、384孔板的PCR反應體系構建,不用加樣加到眼發黑、手抽筋。

2、 硬件設計特點
熒光定量PCR儀主要有傳統的96孔板式、創新的離心式等,每種設計都有它的獨到之處但也都有無法避免的缺憾。
傳統的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大,而且無需特殊的耗材。有些傳統的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發、CCD檢測,這些光學結構在96孔板的頂部,每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同——邊緣效應,對結果產生影響。為了保證精確、準確的實驗結果,這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX(一種熒光染料)或專用的Reference dye作為參照校正實驗結果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經成為很多用戶頭痛的問題。在實驗過程中鹵鎢燈作為一種熱光源,產生較多熱能對實驗結果有一定的影響。CCD最大的優點就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號,但是靈敏度較低,而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。像ABI、Bio-rad 公司生產的熒光定量PCR就屬于這一種。但Bio-rad的IQ系列熒光定量PCR帶有梯度功能。

創新的離心式的儀器通常選用LED激發、PMT檢測,離心式的設計上避免了邊緣效應。LED光源是冷光源對實驗沒有影響,因此無需采用其他熒光染料校正儀器,而且使用壽命長無需經常更換。PMT每次只能收集單個熒光信號,但是檢測靈敏度高。但這類儀器運行速度非常快,但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒有梯度功能、存在時間積分等缺點。Corbett 的Rotor-gene系列和Roche 的Lightcycler系列均為這一類儀器。

隨著熒光定量PCR技術的使用,聰明的儀器生產商紛紛在傳統的96孔板儀器上大作改進。首先是Stratagene的Mx3000p在檢測上突破了使用CCD改用PMT檢測熒光信號,大大提高了實驗的靈敏度,但激發光源仍然沿用傳統的鹵鎢燈并且沒有梯度功能。Eppendorf 公司推出的Mastercycler ep realplex是一款帶有梯度功能的熒光定量PCR儀,使用了96個LED為激發光源,采用先進的CPM(第二代PMT)及96合一光纖為檢測系統,不但避免了邊緣效應還保證所有樣品間的熒光信號沒有干擾。

3、 運行速度
在熒光定量PCR儀的眾多技術參數中,升降溫速度也是廠家喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫,可以縮短反應進行的時間,而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間,提高PCR的特異性。為了更好的完成實驗,各個廠家紛紛推出能快速運行的熒光定量PCR儀。例如ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空氣動力學原理,可在半小時左右完成30-40個循環。ABI的7500可以選配FAST模塊擁有5°C/秒的升降溫速度,可在40分鐘左右完成30-40個循環。最近eppendorf新推出的Mastercycler ep realplex4S 和2S的銀質模塊熒光定量PCR儀 ,升降溫的速度可達到6℃/秒和4.5/秒,是目前同類產品中升降溫速度最快的熒光定量PCR 儀。一個在其他儀器上原本需要40—60分鐘的PCR反應,eppendorf Mastercycler ep realplex4S 和2S (銀質模塊)只需運行28分鐘——別小看這節約下來的幾十分鐘,一天下來就可以多運行好幾輪了。

4、 靈活性
大規模繁忙的實驗室設備固然讓人羨慕,但是常規實驗室同樣可以有精彩的選擇。現在的儀器供應商擁有眾多技術專家,有的還能提供整個分子生物學的基礎研究平臺,不但了解、滿足您現在的需求,而且還考慮到了你可能變化的需求——升級和更換模塊。Bio-rad的Mycycler就可以選擇模塊升級為定量PCR儀。ABI的7900可以選擇將96孔槽變為384孔槽。像離心式的雙通道的Rotor-gene3000A 就可以根據您研究的需要升級成四通道的熒光定量PCR儀。Eppendorf公司在這方面考慮的就更加周全,如實驗室已經擁有Mastercycler ep可以按照您的要求升級為Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀,而且可升級的型號有4種:2通道銀質、鋁制模塊和4通道銀質、鋁制模塊。您可以根據自己的經費和實驗需要購買、升級任何一款Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀。

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